Violoniste de formation (Bourg et CNR Lyon), il pratique aussi l'improvisation au clavier (piano et grand orgue) en autodidacte. Après un passage en facultés de langues germaniques et scandinaves (universités Lyon-III et Lyon-II, 1984-86) puis son Service national (FFA), il poursuit des études de musicologie à l’Université Strasbourg II (Maîtrise en 1991 sous la direction de Georges Bloch, DEA en 1993 sous la direction de François-Bernard Mâche), en classes d’écriture et d’analyse au Conservatoire National de Région de Strasbourg (1988-91), ainsi qu'en classes de composition (Claude Lefebvre) et d’électroacoustique au Centre Européen de la Recherche Musicale de Metz (1990-92). Boursier de la Chancellerie des Universités de Paris (1995), il soutient sa Thèse de Doctorat (musique du XXe siècle) à l'Université Paris-8 Saint-Denis en 1997 (« Epiphanie de l'imperceptible », sous la direction d'Eveline Andréani). Il a été ATER au département Musique & Musicologie de l’Université Paris IV Sorbonne (1996-98). Il enseigne la musique en collèges comme non-titulaire (2000-2006). Il obtient sa Thèse d’Habilitation (HDR) en musicologie (musique du XXe siècle) à l'Université de Provence (Aix-Marseille I) en 2004 (« La réflexion musicologique sous le signe du sensible », sous la direction de Bernard Vecchione).
Matthieu Guillot a collaboré aux revues Etudes et Analyse Musicale (2002-2005). Grâce au soutien et à l'impulsion de Márta Grabócz, dont il a été étudiant, il participe dès 1994 à des colloques et séminaires musicologiques, nationaux et internationaux (Finlande, Italie, Allemagne, Autriche, Belgique, Suisse) jusqu'en 2007. Il cesse ses activités de musicologue, devient employé de librairie pour les Editions L’Harmattan au Village du Livre de Cuisery (Saône-et-Loire), jusqu'en 2014. Il a été organiste de la Paroisse St Jean-Baptiste en Bresse jusqu'en 2019. Musicien indépendant depuis 2015 (piano, synthétiseurs), il a donné des concerts et animé divers lieux. Depuis 1993 il est auteur de nombreux articles, notamment d’esthétique musicale, et de trois ouvrages (2006-2008) parus aux Editions L’Harmattan. Il publie aussi à Vilnius, en Lituanie, des travaux (en revues et collectifs) sur la musique lituanienne contemporaine. Chercheur associé au Gream depuis 2019, il a collaboré en 2019-2020 aux ouvrages collectifs dirigés par Márta Grabócz (à paraître aux Editions Hermann) : Modèles naturels et scénarios imaginaires dans les œuvres de Peter Eötvös, François-Bernard Mâche et Jean-Claude Risset, ainsi que Narratologie musicale (titre provisoire). Il achève un essai musicologique (à paraître aux PUP, Aix, 2020). Il participera prochainement à deux colloques : le 35th International Musicological Symposium of the Slovenian Music Days (communication intiutlée « Operetta as a cultural and historical Symptom. Offenbach through Karl Kraus ») à Ljubljana, prévu initialement en avril 2020 mais finalement reporté à une date ultérieure ; colloque Engagements (communication intitulée « Vanité ou sincérité de l'implication dans l'Histoire. Interprétation de (pseudo ?) messages engagés en musique : autour du thème de la guerre et de l'arme atomique (A. Schönberg, K. Penderecki, J.-C. Risset, Sting, J. Adams) ») à Boulogne-sur-Mer (Université Littoral Côte d'Opale/Université de Limoges) en novembre 2020.